Desain Primer Secara in Silico untuk Amplifikasi Gen TGF- β1 dan TNF- α pada Mencit (Mus musculus) Sebagai Kandidat Primer Dalam Uji qRT-PCR

Abstract

Transforming Growth Factor Beta 1 (TGF-β1) dan Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α) merupakan dua gen penting yang terlibat dalam mekanisme inflamasi dan fibrosis. Penelitian ini bertujuan untuk mendesain kandidat primer spesifik bagim kedua gen tersebut pada hewan model Mencit Mus musculus secara in silico sebagai persiapan uji ekspresi gen menggunakan metode qRT-PCR. Desain primer dilakukan menggunakan software Primer3Plus, Clone Manager Professional 9 Demo, Primer Express, dan OligoAnalyzer untuk mengevaluasi parameter kualitas primer seperti melting temperature (Tm), %GC, struktur sekunder (hairpin dan dimer), serta nilai ΔG. Analisis spesifisitas dilakukan menggunakan Primer-BLAST NCBI untuk memastikan bahwa primer hanya menempel pada target genom Mus musculus. Hasil menunjukkan bahwa kandidat sekuens terbaik yakni primer TGF-β1 forward 5’ ATTCCTGGCGTTACCTTGG 3’; reverse 5’ GTGAGCGCTGAATCGAAAG 3’ dengan produk amplikon 137 bp dan primer TNF-α forward 5’ TGCTCTGTGAAGGGAATGG 3’; reverse 5’ TTGGACCCTGAGCCATAATC 3’ dengan hasil produk 146 bp. Kandidat primer memiliki panjang 19–20 nukleotida, %GC antara 50–55% dan Tm tidak lebih dari 60°c. Tidak ditemukan struktur sekunder baik hairpin atau dimer, dengan nilai ΔG > –3 kcal/mol, menandakan primer stabil. Hasil Primer-BLAST mengonfirmasi bahwa kedua pasangan primer bersifat spesifik terhadap gen target pada Mus musculus dengan nilai 100% sehingga pasangan primer ini layak sebagai kandidat primer untuk aplikasi qRT-PCR dalam studi ekspresi gen terkait inflamasi. Validasi lanjutan di laboratorium tetap diperlukan untuk melakukan reaksi qRT-PCR dengan baik.